《临床微生物学检验实验指导(供医学检验卫生检验医学实验技术等专业使用全国高等院校医学检验专业实验教学规划教材)》编著者费樱。 《临床微生物学检验实验指导(供医学检验卫生检验医学实验技术等专业使用全国高等院校医学检验专业实验教学规划教材)》是全国高等院校医学检验专业实验教 学规划教材之一。全书分三篇，共二十五章。第一篇临床微生物检验基本技术，前四章主要介绍细菌形态学检查、细菌分离培养技术、细菌鉴定技术、抗菌药物敏感 性试验及耐药监测，第五至十五章为临床常见病原微生物的培养、鉴定或检测方法，通过实验课的教学，加强学生对基础理论、基本知识和基本技能的掌握。第二篇 综合性实验从标本送检要求、检验程序、结果解读等方面介绍临床各类标本的细菌学检测，有助于学生综合掌握和运用所学知识，为临床实习和工作打下基础。第三 篇研究创新性实验重点在培养学生进行科学研究的兴趣和基本方法。 本书可作为高等院校医学检验专业、卫生检验专业学生实验用书，也可供临床检验工作者和从事医学研究的科研人员参考使用，并可用做临床医学、医学影像学、麻 醉学、法医学、预防医学及药学等专业实验教学的参考用书。
本书可作为高等院校医学检验专业、卫生检验专业学生实验用书，也可供临床检验工作者和从事医学研究的科研人员参考使用，并可用做临床医学、医学影像学、麻醉学、法医学、预防医学及药学等专业实验教学的参考用书。
第一篇 临床微生物检验基本技术
第一章 细菌形态学检查
第一节 显微镜的使用
第二节 不染色标本检查
第三节 细菌的涂片和革兰染色
第四节 细菌的特殊染色技术和观察
第二章 细菌的分离培养技术
第一节 培养基制备技术
第二节 细菌的接种技术
第三节 细菌的培养方法
第四节 细菌生长现象观察
第三章 细菌鉴定技术
第一节 生物化学鉴定
第二节 血清学鉴定
第三节 动物实验与细菌毒素检测
第四章 抗菌药物敏感性试验与细菌耐药性检测
第一节 纸片扩散法
第二节 稀释法
第三节 E试验
第四节 联合药敏试验
第五节 临床常用特殊耐药菌及耐药酶的表型检测
第五章 革兰阳性球菌的培养和鉴定
第一节 革兰阳性球菌各属间的鉴别
第二节 葡萄球菌属细菌鉴定
第三节 链球菌属和肠球菌属细菌鉴定
第六章 革兰阴性杆菌的培养和鉴定
第一节 革兰阴性杆菌各科或属之间的鉴别
第二节 肠杆菌科细菌的鉴定
第三节 非发酵革兰阴性杆菌的鉴定
第四节 苛氧菌的鉴定
第七章 革兰阴性球菌的培养和鉴定
第八章 弧茵属、弯曲菌属和螺杆菌属细菌的培养和鉴定
第一节 弧菌属
第二节 空肠弯曲菌
第三节 幽门螺杆菌
第九章 需氧革兰阳性杆菌细菌的培养和鉴定
第一节 棒状杆菌属
第二节 需氧芽孢杆菌属
第三节 产单核李斯特菌
第十章 分枝杆菌属、放线菌属和诺卡菌属细菌的培养和鉴定
第一节 结核分枝杆菌
第二节 放线菌属
第三节 诺卡菌属
第十一章 厌氧菌的培养和鉴定
第十二章 螺旋体、支原体和衣原体的实验室检测
第一节 梅毒螺旋体实验室检测
第二节 沙眼衣原体实验室检测
第三节 支原体实验室检测
第十三章 医院感染监测
第一节 手卫生监测
第二节 空气卫生学监测
第三节 物体表面致病菌监测
第十四章 真菌的培养和鉴定
第一节 真菌检验基本技术
第二节 临床常见浅部真菌培养和鉴定
第三节 常见深部真菌培养和鉴定
第十五章 病毒的培养和检测
第一节 病毒培养和检测技术
第二节 常见病毒的检测
第二篇 综合性实验
第十六章 血液及骨髓标本的细菌学检验
第一节 血液及骨髓标本的细菌学检验
第二节 中心静脉导管的细菌学检查(Maki半定量法)
第十七章 尿液标本的细菌学检验
第十八章 呼吸系统标本的细菌学检验
第一节 上呼吸道标本的采集、运送及处理
第二节 下呼吸道标本的采集、运送及处理
第三节 呼吸机相关感染
第十九章 粪便标本的细菌学检验
第二十章 脑脊液标本的细菌学检验
第二十一章 生殖道标本的细菌学检验
第二十二章 穿刺液及脓标本的细菌学检验
第二十三章 临床微生物学检验室内质量控制
第三篇 研究创新型实验
第二十四章 创新型实验实施原则和方法
第二十五章 创新型实验
参考文献
附录
附录1 临床微生物常用培养基
附录2 临床微生物常用生化试验培养基、试剂和染色法
彩图
第一篇 临床微生物检验基本技术
第一章 细菌形态学检查
第一节 显微镜的使用
【实验目的】
1.掌握光学显微镜的结构和原理。
2.掌握光学显微镜使用方法。
【实验原理】
1.显微镜的基本结构 普通光学显微镜的构造主要分为两部分：机械部分和光学部分。
（1）机械系统
1）镜座：是显微镜的底座，用以支持和稳定整个镜体。
2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。
3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。
4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。
5）物镜转换器：位于镜筒下端的旋转盘，可自由转动，盘上有3～4个物镜孔。
6）载物台：在镜筒下方，用以放置标本，中央有一通光孔；装有玻片标本推进器，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可调节标本位置。
7）调焦装置：是装在镜柱上的大小两种螺旋，可调节物镜和标本之间的焦距。大螺旋称粗调节器，移动时可使载物台作较大幅度的升降，通常在使用低倍镜时，先用粗调节器迅速找到物像。小螺旋称细调节器，移动时可使镜台缓慢地升降，可作精密调焦，一般在高倍镜下使用，可得到清晰的物像。
（2）光学系统
1）目镜：装在镜筒的上端，其上刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜，为便于指示图像，镜中装有一根黑丝作为指针。
2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3～4个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。在物镜上，还有镜口率（N.A.）（也称为数值孔径）的标志，它表示该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高。
3）照明装置：装在镜台下方，包括光源和集光器。光源一般采用普通灯光，强度可以自由调节。集光器位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。
2.显微镜的放大成像原理 显微镜的分辨率是由所用光波长短和物镜数值孔径决定，缩短使用的光波波长或增加数值孔径可以提高分辨率。减小光波波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高物镜数值孔径是提高分辨率的理想措施。增加数值孔径，一般通过提高介质折射率，以空气为介质的折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载玻片1.52的折射率相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载玻片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
【实验器材】
普通光学显微镜、细菌革兰染色标本、香柏油、擦镜油、擦镜纸。
【实验方法】
1.取镜和放置 从显微镜柜中取出显微镜，右手紧握镜臂，左手托住镜座，放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿6～7cm左右，便于坐着操作。
2.对光 打开光源开关，转动旋转器，使低倍镜对准镜台的通光孔，打开光圈，上升集光器，在目镜上观察，调节光源强度至视野内的光线均匀明亮。
3.放置玻片标本 取一玻片标本放在镜台上，一定使有标本一面朝上，切不可放反，用推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央。
4.低倍镜和高倍镜使用 先用低倍镜观察，先转动粗调焦手轮，使载物台上升至物镜距标本片约5mm处。并转动粗调节器，使载物台慢慢下降，直到视野中出现清晰的物像为止。如果物像不在视野中心，可调节推片器将其调到中心。转动转换器，调换为高倍镜头，在目镜上观察，此时一般能见到一个不太清楚的物像，可转动细调节器，直到获得清晰的物像。如果视野内的亮度不合适，可通过升降集光器的位置或开闭光圈的大小来调节。
5.油镜的使用方法 在使用油镜之前，先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，使镜头浸入油中，慢慢转动细调节器至物像清晰为止。油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许擦镜油将镜头上的香柏油擦去，再用干擦镜纸擦干净。
【实验结果】
在显微镜油镜下观察到细菌形态。
【注意事项】
1.持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其他地方。
2.轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。
3.保持显微镜的清洁，镜头必须用专用擦镜纸擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。
4.使用完毕后，取下标本片，转动旋转器使镜头离开通光孔，下降载物台和集光器，关闭光圈，盖上外罩，放回显微镜柜内。
第二节 不染色标本检查
【实验目的】
了解不染色标本的观察方法。
【实验原理】
有鞭毛的细菌在液体中可以运动，而无鞭毛的细菌只能发生分子颤动，以此可以观察细菌的运动能力。
【实验器材】
1.菌种 变形杆菌、金黄色葡萄球菌8～12小时肉汤培养物。
2.其他 载玻片、盖玻片、凹玻片、镊子、接种环、显微镜和凡士林等。
【实验方法】
1.压滴法 用接种环取变形杆菌和金黄色葡萄球菌菌液各2～3环，分别置于两张载玻片中央，用镊子夹住盖玻片覆盖于菌液上。覆盖时，先将盖玻片一端接触菌液缓缓放下，使玻片之间不产生气泡，菌液不外溢为适。标本立即置显微镜下观察，先低倍镜找到标本，然后在高倍镜下观察。
2.悬滴法 取变形杆菌或金黄色葡萄球菌肉汤培养物1环分别置盖玻片中央，在另一凹玻片凹窝的周围涂少许凡士林，将凹面向下，对准盖玻片中央，覆于其上，粘住盖玻片后迅速翻转，用小镊子轻压，使盖玻片与凹玻片粘紧，密封凹窝边缘，液滴即悬垂于凹窝中央。
先在低倍镜下找到悬滴边缘，再换用高倍镜观察。
【实验结果】
无论是悬滴法还是压滴法，有鞭毛的变形杆菌可见发生位移的运动现象，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌不发生位置变化。
【注意事项】
1.不能使用陈旧的细菌培养物。
2.压滴法的标本不能产生气泡，以免影响观察。
第三节 细菌的涂片和革兰染色
【实验目的】
1.掌握细菌涂片的制作。
2.掌握革兰染
色方法、原理、结果观察和意义。
【实验原理】
革兰染色法的原理尚不完全清楚，主要有3种学说：
1.通透性学说 革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入，反而使细胞壁脱水后形成一道屏障，阻止染料外渗。革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入，使细胞壁通透性增加，细胞内的染料容易被乙醇溶解脱出。
2.等电点学说 革兰阳性菌等电点（pI2～3）比革兰阴性菌（pI4～5）低，一般染料酸碱度在pH7.0左右，电离后革兰阳性菌所带的负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的碱性染料结晶紫结合牢固，不易脱色。
3.化学学说 革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。
【实验器材】
1.菌种 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌18～24小时斜面培养物。
2.其他 革兰染液、玻片、生理盐水、酒精灯、接种环、显微镜等。
【实验方法】
1.细菌涂片标本的制作
（1）涂片：取洁净玻片一张，用记号笔划分两格并标记金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，用接种环按无菌操作取1～2环生理盐水在玻片上，刮取少许菌苔，在生理盐水中研磨成乳浊状，涂成直径约1cm2的均匀薄膜，然后立即将接种环烧灼灭菌。同法取大肠埃希菌液于另一格中涂片。
（2）干燥：涂片一般在室温下自然干燥，若须迅速干燥，可将涂片膜面朝上，在火焰上方的热空气中加温干燥，但切勿紧靠火焰，以免将标本烤干。
（3）固定：涂片干燥后，在酒精灯火焰上迅速来回通过三次，注意温度不能太高，以玻片反面触及皮肤，热而不烫为度。固定的目的一是杀死细菌，二是使菌体与玻片黏附牢固，染色时不被染液和水冲掉，三是可凝固细胞质，改变细菌胞壁对染料的通透性。
2.革兰染色步骤
（1）初染：将已固定的涂片置染色架上，滴加结晶紫1～2滴，1分钟后用细水流轻轻冲洗。
（2）酶染：滴加碘液1～2滴，1分钟后用细水流轻轻冲洗。
（3）脱色：95%乙醇溶液脱色，加乙醇后轻轻晃动玻片，约30秒后用细水流轻轻冲洗。
（4）复染：滴加稀释石炭酸复红1～2滴，30秒后用细水流轻轻冲洗。待标本自干或用吸水纸印干后，置油镜下观察。
【实验结果】
金黄色葡萄球菌是革兰阳性球菌，被染成紫色；大肠埃希菌是革兰阴性杆菌，被染成红色。
【注意事项】
1.涂片厚薄要适宜，菌膜应该薄而均匀。
2.水洗时，水流不宜过大，避免水流直接对准菌膜冲洗。
3.菌种应选用对数生长期的菌种。
第四节 细菌的特殊染色技术和观察
【实验目的】
1.掌握鞭毛染色法的基本原理和操作方法。
2.掌握芽孢染色法的基本原理和操作方法。
3.掌握荚膜染色法的基本原理和操作方法。
【实验原理】
1.鞭毛染色法 在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。
2.芽孢染色法 芽孢是利用细菌细胞不同部分与染料的亲和力不同，用特殊染色法使之显示出不同的颜色。芽孢染色法就是根据芽孢具有既难以染色而一旦染上色后又不易脱色的特点而设计的。除了用着色力强的染料外，还需加热以促进芽孢着色。孔雀绿染色法，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用沙黄进行复染，此时菌体即被染成红色，而芽孢难着色，仍呈绿色，进而更明显地衬托出芽孢，便于观察。
3.荚膜染色法 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。
【实验器材】
1.菌种 变形杆菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌。
2.染色液 Leifson染色液、芽孢染色液（5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液）、荚膜染色液。
3.其他 载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环，显微镜。
【实验方法】
1.鞭毛染色法
（1）清洗玻片：选择新的玻片，为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20分钟。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5～6天，使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇溶液中脱水。
（2）菌液的制备及制片：在染色前将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上连续培养3～5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种培养12～16小时后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有1ml无菌盐水的试管中，使菌液呈轻度混浊，37℃恒温箱中静置10分钟。用记号笔在洁净的玻片上划分3个相等的区域，吸取少量菌液滴在玻片第一个小区的一端，立即倾斜玻片，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液，自然干燥。
（3）染色：加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，依此类推，其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。
（4）水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。
（5）干燥：自然干燥。
（6）镜检：先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察。
2.芽孢染色法
（1）制备菌液：加1～2滴无菌盐水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环的枯草芽孢杆菌于试管中并充分混匀。
（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
（3）加热：沸水浴15～20分钟。
（4）涂片：用接种环从试管底部挑2环菌液，涂片并晾干。
（5）固定：将涂片来回通过酒精灯火焰3次。
（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
（7）复染：加蕃红水溶液染色5分钟后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干后镜检。
3.荚膜染色法
（1）涂片：按常规方法将肺炎链球菌制成一薄的涂片，自然干燥，加热固定。
（2）染色：滴加结晶紫染液1分钟。
（3）脱色：用20%CuSO4溶液洗去结晶紫，勿水洗，直接用吸水纸吸干后镜检。
【实验结果】
变形杆菌菌体和鞭毛均染成红色结果；枯草芽孢杆菌芽孢呈绿色，芽孢囊和菌体为红色；在蓝紫色背景下，肺炎链球菌菌体呈紫色，荚膜无色或浅紫色。
【注意事项】
1.细菌鞭毛极细，很容易脱落，操作时必须小心谨慎。
2.供芽孢染色用的菌种应控制菌龄。
3.因荚膜为可溶性物质，故染色冲洗时动作要轻柔，防止脱离。
【思考题】
1.为什么用油镜要等标本完全干后才能滴加香柏油？
2.如果显微镜视野光线太强或者太弱，应该怎么调节？
3.细菌涂片过厚对革兰染色有什么影响？
4.革兰染色后，如果金黄色葡萄球菌被染成红色，可能是什么原因造成？
5.细菌不染色标本的检查有什么实际意义？
6.细菌特殊染色标本的检查有什么实际意义？
（夏乾峰）
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