将化学、生物及材料科学等交叉学科的最新研 究成果与生物传感、生物分析方法相结合，发展新型检测原理、传感机制和检测装置，已形成纳米生物传感的新领域。鞠熀先等编著的《纳米生物传感·原理发展与 应用》全面涵盖了各种纳米生物传感方法，包括常用于生物传感的几类主要纳米材料，如碳纳米管、碳纳米纤维、量子点、富勒烯、，荧光材料及生物分子等，阐述 了新的生物传感原理，包括电化学检测、荧光检测、电致化学发光和多种生物识别作用等。
　　《纳米生物传感·原理发展与应用》详细介绍纳米科学、纳米技术与生物传感、生物分析相结合的方法学及传感装置的最新发展，并综述它们在生物医药及环境监测中的应用。本书描述的纳米材料生物功能化及其应用的工作已引起国内外学者的广泛关注，得到了快速发展。
　　读者可以从书中获取大量关于纳米生物传感技术的知识，包括生物传感的原理和应用、生物纳米材料的设计及其功能化，以及新发展的生物传感装置和生物分析方法。

　　21世纪的前十年可以被认为是“传感的十年”。基于纳米材料的生物传感是纳米技术与纳米科学中最热门的领域之一。纳米材料的独特性质为光、电信号的传导提供了优良的平台，被广泛用于新一代生物传感器件的设计与制备。
　　《纳米生物传感·原理发展与应用》介绍纳米生物传感方面的新原理与检测新策略。每章都提供给读者某一主题的理论概述及纳米生物传感器件的有趣的生物分 析应用。本书最令人兴奋的特色是纳米材料的应用不仅增强了生物传感效率，而且带来了新的检测方法学，包括生物仿生、无试剂生物传感、单分子检测等。

鞠熀先，1964年生，南京大学教授、生命分析化学国家重点实验室主任。1986、1989、1992年分获南京大学理学学士、硕士与博士学位，1992年7月留校工作。1993年被聘为副教授，1996年1月至1997年8月为加拿大蒙特利尔大学博士后，1999年被聘为教授、博士生导师，1999～2005年任分析化学教研室主任，2008年任现代分析中心副主任，2009年任教育部重点实验室主任，2011年任国家重点实验室主任。曾为爱尔兰国立大学、德国波茨坦大学和明斯特大学短期访问教授。2003年获国家杰出青年科学基金，2005年成为国家自然科学基金委创新研究群体项目学术带头人，2007年为教育部“长江学者”特聘教授，入选“新世纪百千万人才工程”国家级人选，2010年被选为享受国务院特殊津贴专家，2009年成为“973”计划项目首席科学家。 任中国仪器仪表学会电分析化学专业委员会主任、化学传感器专业委员会副主任，中国化学会分析化学学科委员会副主任、有机分析专业委员会副主任、化学生物学专业委员会委员，江苏省化学化工学会分析化学专业委员会主任，重庆医科大学兼职博士生导师。兼任Electroanal.，Sens.，Anal.Lett.，Sci.Chi.Chem.，Chi.J.ofAnalyti.Chem.等SCI刊物编委；Curr.TrendsBiotechnol.，Pharma.，Am.J.Biomed.Sci.等十多个国际刊物编委；《分析科学学报》、《药学学报》、《中国肿瘤外科学》、《分析测试学报》、《化学传感器》、《分析试验室》和《中国机分析化学》等国内刊物编委。 研究方向为分子诊断与生物分析化学，主要研究领域为免疫分析、细胞分析化学、纳米生物传感和临床分子诊断。已发表论文392篇（含SCI刊物343篇，其中IF＞3.0刊物217篇，＞5.0刊物122篇）；获得专利21件（15件授权），撰写并发表英文专著2部，中文专著、教材4部，国外8部专著和国内6部著作专章各1篇。论文被SCI刊物他人引用8000多次，h-index为53。曾获中国化学会青年化学奖、梁树权分析化学基础研究奖、江苏省青年科学家奖或称号，获教育部自然科学奖一等奖2项，教育部科技进步奖三等奖2项，中国分析测试协会科学技术奖一等奖2项，江苏省科技进步奖二等奖2项、一等奖（合作）1项等。

雷建平 1974年生，南京大学教授，教育部新世纪优秀人才。1996和2001年分获南京大学学士和硕士学位，2004年9月获日本金泽大学博士学位，2005年1月至2006年8月为美国斯坦福大学博士后，2006年9月被聘为南京大学副教授，2010年被聘为教授，2011年聘为博士生导师。研究方向为生物电化学、生物分析与纳米生物传感。近五年在Chem.Soc.Rev.，Angew.Chem.Int.Ed.，Anal.Chem.和Chem.Commun.等SCI刊物发表论文66篇（其中IF＞5.0刊物40篇）。曾获高等学校自然科学奖一等奖、江苏省科技进步奖二等奖和中国分析测试协会科学技术奖一等奖各1项。吴洁 1981年生，南京大学副教授。2003年毕业于东北师范大学，2008年获南京大学博士学位，2008年6月至2010年4月为美国加州大学圣地亚哥分校博士后，2010年10月被聘为南京大学副教授。研究方向为生物分析化学与临床分子诊断。已发表论文28篇（其中Nat.Commun.，Anal.Chem.，Clin.Chem.等IF＞5.0刊物18篇）。曾获江苏省科技进步奖二等奖、中国分析测试协会科学技术奖一等奖、宝钢教育基金会优秀学生奖特等奖（2007年度）和江苏省优秀博士论文奖（2009年度）。鞠熀先 1964年生，南京大学教授、生命分析化学国家重点实验室主任，本书第一作者。1986、1989、1992年分获南京大学理学学士、硕士与博士学位，1992年7月留校工作。1993年被聘为副教授，1996年1月至1997年8月为加拿大蒙特利尔大学博士后，1999年被聘为教授、博士生导师，1999～2005年任分析化学教研室主任，2008年任现代分析中心副主任，2009年任教育部重点实验室主任，2011年任国家重点实验室主任。曾为爱尔兰国立大学、德国波茨坦大学和明斯特大学短期访问教授。2003年获国家杰出青年科学基金，2005年成为国家自然科学基金委创新研究群体项目学术带头人，2007年为教育部“长江学者”特聘教授，入选“新世纪百千万人才工程”国家级人选，2010年被选为享受国务院特殊津贴专家，2009年成为“973”计划项目首席科学家。任中国仪器仪表学会电分析化学专业委员会主任、化学传感器专业委员会副主任，中国化学会分析化学学科委员会副主任、有机分析专业委员会副主任、化学生物学专业委员会委员，江苏省化学化工学会分析化学专业委员会主任，重庆医科大学兼职博士生导师。兼任Electroanal.，Sens.，Anal.Lett.，Sci.Chi.Chem.，Chi.J.ofAnalyti.Chem.等SCI刊物编委；Curr.TrendsBiotechnol.，Pharma.，Am.J.Biomed.Sci.等十多个国际刊物编委；《分析科学学报》、《药学学报》、《中国肿瘤外科学》、《分析测试学报》、《化学传感器》、《分析试验室》和《中国无机分析化学》等国内刊物编委。研究方向为分子诊断与生物分析化学，主要研究领域为免疫分析、细胞分析化学、纳米生物传感和临床分子诊断。已发表论文392篇（含SCI刊物343篇，其中IF＞3.0刊物217篇，＞5.0刊物122篇）；获得专利21件（15件授权），撰写并发表英文专著2部，中文专著、教材4部，国外8部专著和国内6部著作专章各1篇。论文被SCI刊物他人引用8000多次，h-index为53。曾获中国化学会青年化学奖、梁树权分析化学基础研究奖、江苏省青年科学家奖或称号，获教育部自然科学奖一等奖2项，教育部科技进步奖三等奖2项，中国分析测试协会科学技术奖一等奖2项，江苏省科技进步奖二等奖2项、一等奖（合作）1项等。

《新生物学丛书》丛书序
译者前言
前言
第1章 纳米材料的生物功能化
1.1 引言
1.2 纳米材料的生物功能化方法
1.3 纳米材料的生物功能化
1.4 生物功能纳米材料的表征
1.5 生物功能纳米材料的应用
1.6 结论
参考文献

第2章 纳米生物传感的信号放大
2.1 引言
2.2 纳米粒子放大的光学检测
2.3 纳米粒子放大的电化学检测
2.4 纳米粒子作为载体用于信号放大
2.5 结论
参考文献

第3章 生物催化与传感中的纳米结构模拟酶
3.1 引言
3.2 人工模拟酶中的纳米材料
3.3 模拟酶传感器
3.4 结论
参考文献
4.1 引言
4.2 卟啉与碳基纳米材料的组装
4.3 卟啉在半导体纳米粒子上的组装
4.4 卟啉在金属纳米粒子上的组装
4.5 其他纳米材料
4.6 结论
参考文献

第5章 基于碳纳米纤维复合材料的生物传感
5.1 引言
5.2 碳纳米纤维的合成
5.3 采用碳纳米纤维的原因
5.4 基于碳纳米纤维的电化学生物传感器和生物分析
5.5 结论
参考文献

第6章 基于纳米孔材料的生物传感器
6.1 引言
6.2 固定蛋白质的原因
6.3 基于介孔材料的生物传感器
6.4 基于纳米多孔金的生物传感器
6.5 结论
参考文献

第7章 基于碳纳米管的电化学生物传感
7.1 引言
7.2 碳纳米管功能化的方法
7.3 碳纳米管传感器的构建及表征
7.4 信号传导放大
7.5 基于功能化碳纳米管的电化学传感
7.6 基于SwcNTs的场效应生物传感
7.7 单壁碳纳米管阵列的电化学生物传感
7.8 结论和展望
参考文献

第8章 基于纳米粒子发光体的电致化学发光生物传感
8.1 引言
8.2 纳米晶体电致化学发光原理
8.3 电致化学发光生物传感策略及其应用
8.4 结论
参考文献

第9章 分子印迹纳米材料在生物传感中的应用
9.1 引言
9.2 分子印迹技术
9.3 MIPs材料的类型
9.4 MIPs纳米材料的发展
9.5 MIPs生物传感器
9.6 结论
参考文献

第10章 基于溶胶凝胶纳米粒子的生物传感器
lO.1 引言
10.2 溶胶一凝胶化学
10.3 基于溶胶一凝胶纳米粒子的生物传感器
10.4 结论
参考文献

第11章 纳米结构在一氧化氮电化学传感中的应用
11.1 引言
11.2 纳米结构在一氧化氮测定中的应用
11.3 NO电化学传感器中的纳米材料
11.4 结论
参考文献

第12章 味道传感中的纳米组装
12.1 引言
12.2 纳米组装薄膜在味觉传感器中的应用
12.3 基于纳米金一荧光聚合物的传感器阵列在生物传感中的应用
12.4 基于纳米材料催化活性的光传感器及阵列
12.5 结论
参考文献

第13章 纳米生物传感在农药检测中的应用
13.1 引言
13.2 酶生物传感器在农药检测中的应用
13.3 纳米生物传感器在农药检测中的应用
13.4 农药免疫传感器
13.5 纳米技术在AChE活性和农药生物监测方面的应用
13.6 结论
参考文献

第14章 纳米生物传感用于糖基检测
14.1 引言
14.2 多糖的结构
14.3 糖基的生物学作用
14.4 基因糖基化缺陷研究的难点
14.5 蛋白质一糖相互作用
14.6 糖及其衍生物的识别技术
14.7 纳米技术
14.8 结论
参考文献

第15章 纳米材料在免疫传感及免疫分析中的应用
15.1 引言
15.2 免疫分析与免疫传感器的原理
15.3 基于生物兼容性材料的免疫传感器
15.4 结论
参考文献

第16章 纳米结构生物传感及生物芯片在DNA分析中的应用
16.1 导论
16.2 DNA生物传感中的纳米结构
16.3 用于DNA生物芯片的纳米结构
16.4 结论
参考文献

第17章 纳米组装用于细胞传感和细胞表面糖基分析
17.1 引言
17.2 在细胞传感中使用纳米材料的原因
17.3 基于纳米组装的细胞传感
17.4 基于纳米组装的细胞表面聚糖检测
17.5 结论
参考文献

第18章 纳米生物传感在临床诊断中的应用
18.1 引言
18.2 纳米技术在生物传感中的应用
18.3 纳米生物传感用于临床诊断
18.4 结论
参考文献
彩图

第1章 纳米材料的生物功能化
1.1引言
纳米尺度材料（1~200nm）的独特性能，为光、电信号传导和新一代生物电子/生物传感器件的设计提供了优良的平台。然而，纳米粒子（NPs）的生物相容性和生物识别能力的缺陷限制了它们在分析检测中的应用。纳米材料的生物功能化可以赋予其良好的生物相容性，有利于生物分子、组织和细胞的固定，同时在生物识别中表现出高的特异性［1~6］，可用来构建具有良好选择性和重现性的生物传感系统。特别是，生物功能化的纳米粒子在催化活性、导电性和生物相容性方面能产生协同效应，加速信号的转化与传递，通过信号放大实现对靶标的快速、高灵敏响应。对超灵敏生物检测的需求和微型化检测的发展趋势使纳米材料的生物功能化成为最热门的领域之一。因此，探索用生物分子如蛋白质、DNA、有机小分子、聚合物薄膜甚至整个活细胞来对纳米材料进行功能化的适当方法已经引起广泛重视。
纳米材料的表面功能化有两种途径：一是通过非共价相互作用，包括物理吸附和包裹，将生物分子修饰于纳米粒子表面；二是通过共价相互作用将功能基团连接到纳米粒子的表面［7~10］。非共价功能化途径通过静电相互作用、π•π堆积作用或范德华力来实现生物分子在纳米粒子表面的固定。此种方式能避免纳米粒子共轭骨架及电性质的破坏，是一种十分有效的固定方式。纳米粒子的共价功能化途径可再细分为三种方式：直接化学作用、交联剂辅助连接以及“点击”化学方法。相比于非特异性物理吸附，共价连接通常具有更好的稳定性和重复性。
功能纳米材料在日益增长的微型化、新特性和新功能需求以及多技术联用的发展等方面均有广阔应用前景。在开发光、电学生物传感器时，纳米粒子与生物分子的结合可出色地完成生物现象的信号转化［11~14］。一方面，因为灵敏度高、动态范围宽和功能多元化的特点，光学检测在生物传感器设计中具有优势。与有机染料和荧光蛋白相比，荧光能量转移纳米磁珠和量子点（QDs）等纳米探针在亮度、光稳定性和多色发射方面有显著优势。另一方面，基于分子纳米探针的电化学检测因其成本低、灵敏度高和设备简单而备受关注。通过检测包被在微珠上电活性分子的电化学放大信号，可以使DNA的电化学检测的检测限低至100amol/L［15］。此外，纳米粒子与介质直接接触，可以作为化学和生物传感器，用于生物分子的单分子电化学检测。
本章重点介绍利用生物分子对纳米材料进行生物功能化的基本策略，并将突出生物功能化纳米材料作为优良的电信号或光信号转化器在生物分析方面的一些精妙应用。
1.2纳米材料的生物功能化方法
在超分子化学获得巨大成功的基础上，利用包括物理吸附、静电结合、特异性识别和共价偶联在内的多种技术，可以将纳米粒子进行分子和生物分子功能化，组装成杂化复合体系。
1.2.1非共价组装的生物功能化
1.物理吸附
生物分子在纳米粒子上的简单吸附经常用于纳米粒子的生物功能化，其中生物分子的范围可从小分子有机物到蛋白质/酶大分子［2］。对于由羧酸衍生物、柠檬酸根、酒石酸根和硫辛酸等阴离子配体稳定的纳米粒子，能够通过其表面带负电荷的阴离子基团有效结合到蛋白质带正电荷的氨基酸侧链上（图1.1）。例如，柠檬酸还原法制备的金（Au）纳米粒子可在略高于柠檬酸配体等电点的pH下被抗癌胚抗原的抗体分子功能化［16］。另一个获取蛋白质涂层的例子是通过静电相互作用在巯基乙酸（TGA）外壳的CdSe量子点颗粒表面直接吸附氧化酶［17］。
静电驱动下带负电荷的DNA在带正电荷的富Cd2+型CdS纳米粒子上的吸附已用于制备“无机蛋白质”［18］。单链DNA（ssDNA）可通过π•π作用包裹在单壁碳纳米管（SWCNTs）上，形成可溶的DNA•SWCNTs复合物。这已用于构建高灵敏检测靶标蛋白质的传感器，为基于碳纳米管（CNT）的生物技术应用开辟了新途径［19］。
对于碳基纳米材料来说，芘、卟啉及其衍生物等芳香分子均可与其侧壁通过π•π堆积形成相互作用。Chen等［20］针对单壁碳纳米管侧壁的非共价功能化设计了一个值得注意的一般性方法，即通过N•琥珀酰亚胺•1•芘丁酸将生物分子固定到单壁碳纳米管上。卟啉和单壁碳纳米管之间的直接π•π相互作用对质子化卟啉在单壁碳纳米管表面有序组装成J形和H形聚集体起着重要作用［21］。
另一种在纳米粒子表面固定生物分子的方法是将它裹入生物相容的聚合物中，如聚乙二醇、Nafion膜、壳聚糖和共聚物。该涂层聚合物不仅可以防止纳米粒子的聚集，还为进一步生物分子的功能化提供丰富位点。特别是电活性聚合物，在电化学氧化过程中可以产生大量电子，起到放大电化学信号的作用，提高检测灵敏度。例如，聚酪氨酸可作为电活性探针用于前列腺特异性抗原（PSA）的检测，检测限约为1nmol/L［22］。将氧化还原聚合物聚乙烯咪唑与氯化二（4，4′•二甲基联吡啶）锇复合后，电沉积到钽基底的多壁碳纳米管（MWCNTs）上，可提高葡萄糖检测的灵敏度［23］。
生物分子，尤其是蛋白质或酶的静电沉积，也可以扩展到多层组装。这个策略可实现在纳米粒子上制备高密度的酶分子功能膜。例如，用聚电解质（聚二烯丙基二甲基氯化铵）（PDDA）修饰多壁碳纳米管后，通过层层（LBL）组装技术，可构建由多壁碳纳米管和葡萄糖氧化酶（GOx）组成的均一、稳定的多层膜（图1.2）。这种碳纳米管组装膜含有多孔结构，对溶解氧的还原有电催化活性［24］。碳纳米管载体上的静电层层自组装可使酶标记比例最大化，产生与碱性磷酸酶示踪剂相关的最大放大系数。基于这种生物电子的放大方法能检测低至80个拷贝的DNA（5.4amol/L）和2000个分子的蛋白质（67amol/L）［15］。通过量子点在碳纳米管上的静电吸附可制备CdSe量子点•碳纳米管复合物，构建电致化学发光（ECL）免疫传感器［25］。在涂饰聚电解质的亚微米级乳胶球上静电组装Au纳米粒子，可用于超灵敏DNA检测［26］。
2.特异性亲和作用
利用亲和作用来完成靶向配体与纳米粒子的生物结合是非常有效的。亲和作用是高特异的互补识别结合作用，如抗原抗体、核酸•DNA、凝集素•糖基、链霉亲和素•生物素、适体•蛋白质、适体•生物小分子和激素•受体的相互作用。此外，各类生物分子含有多个结合位点，如抗体表现出两个Fab（抗原结合片段）位点，每个链霉亲和素或刀豆蛋白A分子都有四个结合域，纳米结构可以在多个方向上生长。如图1.1所示，纳米粒子的表面可修饰链霉亲和素，与生物素化的分子进行特异性结合，形成的结合物高度稳定，是所有的非共价键合中最强的。与疏水性和静电相互作用不同的是，亲和作用对环境条件（如pH、盐度或亲水性）的变化不敏感。例如，亲和素功能化的Ce/Tb掺杂LaPO4纳米粒子已用于生物素化蛋白和寡核苷酸的超级自组装［27］。由于生物素化的分子很容易获得，这些生物素化的结合物在生物传感与生物标记等方面具有广泛的适用性。适体是源于体外筛选（SELEX）的单链短核酸序列，因其可作为蛋白质和其他生物小分子的新型识别元件而引起很大的兴趣。适体相对抗体的竞争优势在于高特异性和亲和力、化学稳定性好，实用性强和灵活性高，已成为有前途的蛋白质检测工具。很多基于适体的技术通过结合聚合酶链反应（PCR）、电化学、毛细管电泳、质谱和石英晶体微天平已用于一系列蛋白质的高灵敏检测。通过适体对靶标生物分子的特异性识别，适体功能化的纳米粒子将为新的生物传感和生物分析系统的构建提供一个有潜力的平台。最近，利用凝集素和糖抗原表位之间的特异识别构建了刀豆蛋白A功能化金纳米探针，通过电化学跟踪纳米粒子上共固定的酶来实现活细胞表面糖基团的高灵敏和高选择地原位评估［28］。利用精氨酸•甘氨酸•天冬氨酸•丝氨酸四肽和细胞表面整合素的特异亲和作用，在四肽功能化的单壁碳纳米管修饰电极上有效捕捉细胞，通过辣根过氧化物酶（HRP）标记的四种凝集素可同时监测药物作用过程中四种细胞表面糖基的动态变化［29］。
1.2.2纳米材料的共价生物功能化
1.直接化学反应
总体上来看，可控的共价反应组装路线在表面功能化的稳定性和重复性方面优于非特异性的物理吸附。在直接反应策略中，纳米粒子表面官能团可在催化剂促进下直接与反应配体键合。纳米粒子表面巯基、氨基、醛和羧酸官能团可被靶向识别。
首先，硫醇类分子（如寡肽）与金纳米粒子的结合为生物分子共价连接纳米粒子提供了一种手段［30］。此外，二巯基丁酸外壳CdTe纳米粒子可利用巯基与纳米粒子表面Cd2+的强作用力，通过直接化学反应完成生物分子功能化［31］。在某些情况下，蛋白质在Au纳米粒子上的紧密化学吸附是因为蛋白质半胱氨酸残基上的巯基结合到Au纳米粒子表面［32］。对没有硫醇残基的天然蛋白质，可用化学方法将2•亚氨基硫烷结合到蛋白质上衍生出巯基［3］。
其次，含羧酸基团的纳米粒子与含伯胺的生物分子可通过1•乙基•3•（3•二甲基氨基丙基）亚胺（EDC）/N•羟基琥珀酰亚胺（NHS）连接剂共价键合［33］。这种方法已用于纳米粒子与DNA、适配体以及抗体•抗原的连接。通常在3∶1H2SO4/HNO3中超声4~6h，缩短多壁碳纳米管长度，同时引入亲水的羧基（图1.3）。pH6.0下用1mL400mmol/L的EDC和100mmol/L的NHS活化蛋白分子，如作为第二抗体的抗PSA抗体（Ab2），可附着在多壁碳纳米管表面［34］。同样，带有氨基的纳米粒子可与含羧基生物分子共价结合，将肽、蛋白质、抗体和酶结合到纳米粒子上。
最后，用于修饰金属氧化物纳米粒子的主要化合物是硅烷、羧酸和磷酸酯。硅烷是金属氧化物表面最常用的修饰剂，因为它可以承载包括氨基酸、氰基、羧酸和环氧基团在内的众多官能团，便于后续的功能化。此外，通过单齿配位、吸附桥联或吸附螯合连接生物分子的羧酸和磷酸基，可对金属氧化物纳米粒子的表面进行生物功能化，这也是一种有效的方法［8］。
2.交联化学反应
生物分子，尤其是蛋白质，与未受保护的固体基底直接接触时都会发生不同程度的变性，随之发生特定生化功能的损失。低相对分子质量的双官能团交联剂带有附着在纳米粒子表面的锚定基团和进一步共价偶联靶标生物分子功能基团，已被广泛应用于制备生物分子与各种纳米粒子的共价偶联结合物。双官能团交联剂的锚定基团如硫醇、二硫基或膦基配体往往用于结合Au、Ag、CdS和CdSe纳米粒子。这些锚定基团很容易取代弱吸附分子来稳定纳米粒子，或在合成纳米粒子时被引入，实现纳米粒子表面功能化，用于进一步反应。
不同的双官能团交联剂上有多种端基官能团。最常见的胺、活性酯、异硫氰酸盐和马来酰亚胺基团可通过碳二亚胺介导的酯化和酰胺化反应或通过巯基反应来共价偶联生物化合物（图1.4）［6］。连接分子的主要作用不仅为生物分子的特定附着提供高密度的对接位点，也保持了纳米粒子表面足够低的电子缺陷密度。
用硫代磷酸化的DNA结合一个短的双功能扣件（BF）已发展了一种沿DNA链组装纳米粒子的新方法，能够精确控制粒子的位置和间距。双功能扣件一端的烷基硫醇可以结合一个Au纳米粒子，另一端的碘乙酰胺基团可以结合改性DNA骨架上的硫代磷酸基团［35］。
“点击”化学，即铜催化叠氮•炔环加成反应，是Sharpless等十多年前发展的一种相对较新的直接结合方法［36］。点击反应快速、高效，反应条件温和（水相环境、相对中性的pH），能产生水溶性和生物相容性的键合。与其他直接结合策略相比，该方法有多种独特的性质。一是叠氮和炔烃反应基团彼此高度特异，且不与大多数官能团反应，可确保活性基团在所需位置上的特异结合。二是其生成的键高度稳定。与之形成对比的是酰胺键可被水解反应剪切开来，而二硫键很容易在还原环境下被剪切。三是成键刚性很强，这有助于保持纳米粒子表面反应基团的构象，防止交叉反应。
“点击”化学方法简单、几乎按化学量完成，目前已用于聚合物的制备和材料科学［37］。含有炔或叠氮基的纳米粒子表面可偶联与其互补的功能化生物活性分子。通过一步“点击”反应，载药高分子纳米粒子可被叶酸、生物素和金纳米粒子功能化（图1.5）［38］。通过“点击”化学技术将甘氨酸•精氨酸•甘氨酸•天冬氨酸•丝氨酸线性梯度肽固定在多功能的衬底上，用作监测表面定向细胞功能的工具［39］。
“点击”化学已成为获得低焦化的抗体功能化纳米工程聚合物胶囊的一般方法。甚至靶细胞数低于细胞总数0.1%时，抗体功能化的胶囊仍能特异结合结肠癌细胞［40］。通过“点击”反应在非氧化的硅基底上高效接枝寡聚（乙二醇）链也可获得高度耐非特异性蛋白质吸附的表面［41］。
4.纳米材料生物功能化的活化方法
纳米粒子表面经巯基、氨基、羧基、羟基等基团修饰后，其进一步生物功能化有时需活化这些基团，使之能与选择配体反应。激活功能纳米粒子表面的方法必须与配体和纳米粒子相匹配。其一般方法归纳如下。
胺的反应化学是第一类用于活化纳米粒子表面的方法。这里用溴化氰（CNBr）活化羟基。它可以在较高pH下与―OH基团反应产生一个活性很高的氰酸酯，再直接与胺基反应。这种方法几乎普遍用于活化含羟基的纳米粒子。溴化氰活化的纳米粒子可用于偶联小的配体及含伯胺基团的高相对分子质量生物聚合物。该步骤将敏感的酶和抗体等生物分子偶联到纳米粒子上，操作相对简单，重现性好。另一种胺的活化方法是以NHS为活化基团，与伯胺基团形成酰胺键。NHS可活化―OH和―COOH基团，反应产生的NHS酯能非常有效地与含伯胺基团的配体形成稳定的酰胺键。在羧基活化方面，N，N′•羰基二咪唑（CDI）和EDC是高活性羰基化试剂。在含伯胺基团的化合物存在下，CDI的咪唑基被取代，形成稳定的酰胺键。有时，CDI也可以用来活化含羟基的纳米粒子。EDC可介导两种方式的交联：含胺纳米粒子偶联含羧基的配体或含羧基纳米粒子偶联含胺的配体。
醛和酮与伯胺和仲胺反应，形成可逆的Schiff碱，进一步用还原剂如硼氢化钠还原，可获得稳定的共价键合。因此，含伯胺基团或仲胺基团的生物分子可通过这些反应结合到纳米粒子上。关键步骤是在纳米粒子表面引入醛基，这可以由NaIO4氧化琼脂糖上邻二醇来完成。因此，第一步利用琼脂糖凝胶或缩水甘油功能化纳米粒子，后者可与―OH反应在纳米粒子表面引入邻羟基。