《细胞生物学实验/全国高等院校医学实验教学规划教材》介绍了细胞生物学常用的实验技术和方法，其编者们均为细胞生物学教学和研究的一线教师，在高等医学院校工作多年。《细胞生物学实验/全国高等院校医学实验教学规划教材》将作者的科学研究工作经验融入到设计性和创新性实验的内容中，使其具有较强的实践性。《细胞生物学实验/全国高等院校医学实验教学规划教材》共三篇，包括细胞生物学基础性实验21个、综合性实验13个以及设计性和创新性实验选题5个。基础性和综合性实验主要描述实验方法与步骤，内容简明扼要，切实可行，主要试剂配制均有说明，实用性强；设计性和创新性实验选题主要是将细胞生物学技术应用于目前的研究热点领域，对学生进行创新能力和综合能力的培训，引导学生进行毕业论文设计和科研设计。

第一篇 基础性实验
第一章 显微镜的原理及应用
实验1 普通光学显微镜
实验2 倒置相差显微镜
实验3 荧光显微镜
实验4 激光共聚焦显微镜
实验5 电子显微镜
第二章 细胞形态与结构观察
实验6 细胞形态的观测及显微测量
实验7 间接免疫荧光法观察微管
实验8 鬼笔环肽对微丝的标记与观察
实验9 考马斯亮蓝R250显示植物细胞骨架
实验10 线粒体的活体染色与观察
第三章 细胞生理
实验11 细胞膜的通透性
实验12 细胞膜的流动性
实验13 植物凝集素对红细胞的凝集作用
实验14 小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬实验
第四章 细胞化学成分的显示
实验15 细胞中DNA和RNA的显示
实验16 细胞中酸性蛋白和碱性蛋白的显示
实验17 细胞中酶类的显示
实验18 细胞中脂类的显示
实验19 细胞中糖类的显示
第五章 细胞分裂
实验20 细胞无丝分裂与有丝分裂标本观察
实验21 减数分裂标本的制备与观察


第二篇 综合性实验
实验22 组织切片的制作及染色
实验23 细胞核与线粒体的分离分级
实验24 小鼠骨髓染色体的制备
实验25 细胞原代培养与细胞鉴定
实验26 细胞的传代培养和细胞计数
实验27 培养细胞的冻存与复苏
实验28 细胞融合
实验29 细胞增殖的检测
实验30 FCM周期时相的检测及分析
实验31 细胞凋亡的检测
实验32 细胞运动
实验33 早熟染色体凝集
实验34 细胞衰老的诱导与半乳糖苷酶染色观察


第三篇 设计性和创新性实验
选题一 抗肿瘤药物有关研究
选题二 间充质干细胞的培养和应用研究
选题三 滋养层细胞培养及其行为的研究
选题四 力学刺激对细胞生物学功能的影响
选题五 细胞相互作用的研究
彩图

　　《细胞生物学实验/全国高等院校医学实验教学规划教材》：
　　第一篇 基础性实验
　　第一章 显微镜的原理及应用实验1普通光学显微镜【实验目的】
　　（1）熟悉普通光学显微镜的主要构造及其性能。
　　（2）掌握低倍镜及高倍镜的使用方法。
　　（3）初步掌握油镜的使用方法。
　　（4）了解光学显微镜的维护方法。
　　【实验用品】
　　1.材料永久装片。
　　2.器材普通光学显微镜、擦镜纸、香柏油等。
　　3.试剂清洁剂（V乙醚：V无水乙醇=7∶3）、二甲苯。
　　【实验内容】
　　1.光学显微镜的原理光学显微镜（lightmicroscope）是生物科学和医学研究领域常用的仪器，它在细胞生物学、组织学、病理学、微生物学及其他有关学科的教学研究工作中有着极为广泛的用途，是研究人体及其他生物机体组织和细胞结构强有力的工具。
　　光学显微镜简称光镜，是利用光线照明使微小物体形成放大影像的仪器。目前使用的光镜种类繁多，如暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜，倒置显微镜等，其外形和结构差别较大，有些类型的光镜有其特殊的用途，但其基本的构造和工作原理是相似的。普通光镜主要由机械系统和光学系统两部分构成，光学系统主要包括光源、反光镜、聚光器、物镜和目镜等部件。
　　光镜是如何使微小物体放大的呢？物镜和目镜的结构虽然比较复杂，但它们的作用都是相当于一个凸透镜，由于被检标本是放在物镜下方的1~2倍焦距位置的，上方形成倒立的放大实像，该实像正好位于目镜的下焦点（焦平面）范围之内，目镜进一步将它放大成一个虚像，通过调焦可使虚像落在眼睛的明视距离处，在视网膜上形成一个直立的实像。显微镜中被放大的倒立虚像与视网膜上直立的实像是相吻合的，该虚像看起来好像在离眼睛25cm处。
　　分辨率（resolution）是光镜的主要性能指标。所谓分辨率，是指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，即分辨出标本上相互接近的两点间的最小距离的能力。据测定，人眼的分辨率约为100μm。显微镜的分辨率由物镜的分辨率决定，物镜的分辨率就是显微镜的分辨率，而目镜与显微镜的分辨率无关。光镜的分辨率（R）（R值越小，分辨率越高），可以下式计算：
　　R=0.6λnsinθ
　　n为聚光镜与物镜之间介质的折射率（空气为1、油为1.5）；θ为标本对物镜镜口张角的半角，sinθ的最大值为1；λ为照明光源的波长（白光约为0.5m）。
　　放大率或放大倍数是光镜性能的另一重要参数，一台显微镜的总放大倍数等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。
　　2.普通光学显微镜的基本构造（图1-1）及功能
　　图1-1普通光学显微镜的构造
　　（1）机械部分
　　1）镜筒：为安装在光镜最上方或镜臂前方的圆筒状结构，其上端装有目镜，下端与物镜转换器相连。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式或双筒式两类。单筒光镜又分为直立式和倾斜式两种。而双筒式光镜的镜筒均为倾斜的。镜筒直立式光镜的目镜与物镜的中心线互成45°角，在其镜筒中装有能使光线折转45°角的棱镜。
　　2）物镜转换器：又称物镜转换盘。是安装在镜筒下方的圆盘状构造，可以按顺时针或反时针方向自由旋转。其上均匀分布有3~4个圆孔，用以装载不同放大倍数的物镜。转动物镜转换盘可使不同的物镜到达工作位置（即与光路合轴）。使用时注意所需物镜准确到位。
　　3）镜臂：为支持镜筒和镜台的弯曲状构造，是取用显微镜时握拿的部位。镜筒直立式光镜在镜臂与其下方的镜柱之间有一倾斜关节，可使镜筒向后倾斜一定角度以方便观察，但使用时倾斜角度不应超过45°，否则显微镜则由于重心偏移容易翻倒。在使用临时装片时，千万不要倾斜镜臂，以免液体或染液流出，污染显微镜。
　　4）调焦器：也称调焦螺旋，为调节焦距的装置，位于镜臂的上端（镜筒直立式光镜）或下端（镜筒倾斜式光镜），分粗调螺旋（大螺旋）和细调螺旋（小螺旋）两种。粗调螺旋可使镜筒或载物台以较快速度或较大幅度升降，能迅速调节好焦距使物像呈现在视野中，适于低倍镜观察时的调焦。而细调螺旋只能使镜筒或载物台缓慢或较小幅度的升降（升或降的距离不易被肉眼观察到），适用于高倍镜和油镜的聚焦或观察标本的不同层次，一般在粗调螺旋调焦的基础上再使用细调焦螺旋，精细调节焦距。
　　有些类型的光镜，粗调螺旋和细调螺旋重合在一起，安装在镜柱的两侧。左右侧粗调螺旋的内侧有一窄环，称为粗调松紧调节轮，其功能是调节粗调螺旋的松紧度（向外转偏松，向内转偏紧）。另外，在左侧粗调螺旋的内侧有一粗调限位环凸柄，当用粗调螺旋调准焦距后向上推紧该柄，可使粗调螺旋限位，此时镜台不能继续上升但细调螺旋仍可调节。
　　5）载物台：也称镜台，是位于物镜转换器下方的方形平台，是放置被观察的玻片标本的地方。平台的中央有一圆孔，称为通光孔，来自下方光线经此孔照射到标本上。在载物台上通常装有标本移动器（也称标本推进器），移动器上安装的弹簧夹可用于固定玻片标本，另外，转动与移动器相连的两个螺旋可使玻片标本前后左右地移动，这样寻找物像时较为方便。
　　6）镜柱：为镜臂与镜座相连的短柱。
　　7）镜座：位于显微镜最底部的构造，为整个显微镜的基座，用于支持和稳定镜体。有的显微镜在镜座内装有照明光源等构造。
　　（2）光学系统部分：光镜的光学系统主要包括物镜、目镜和照明装置（光源、聚光器和光圈等）。
　　1）目镜：又称接目镜，安装在镜筒的上端，起着将物镜所放大的物像进一步放大的作用。每个目镜一般由两个透镜组成，在上下两透镜（即接目透镜和会聚透镜）之间安装有能决定视野大小的金属光阑——视场光阑，此光阑的位置即是物镜所放大实像的位置。另外，还可在光阑的上面安装目镜测微尺。每台显微镜通常配置2~3个不同放大倍率的目镜，常见的有（5×）、（10×）和（15×）（×表示放大倍数）的目镜，可根据不同的需要选择使用，最常使用的是（10×）目镜。
　　2）物镜：也称接物镜，安装在物镜转换器上。每台光镜一般有3~4个不同放大倍率的物镜，每个物镜由数片凸透镜和凹透镜组合而成，是显微镜最主要的光学部件，决定着光镜分辨率的高低。常用物镜的放大倍数有（4×）、（10×）、（40×）和（100×）等几种。一般将（4×）、（10×）的物镜称为低倍镜；将（40×）以上的物镜称为高倍镜；（100×）的物镜通常为油镜，这种镜头在使用时需浸在镜油中。
　　在每个物镜上通常都刻有能反映其主要性能的参数（图1-2）：主要有放大倍数和数值孔径（如10/0.25、40/0.65和100/1.25）。该物镜所要求的镜筒长度和标本上的盖玻片厚度（160/0.17：单位：mm）等。另外，在油镜上还常标有“油”或“Oil”的字样，物镜分辨率的大小取决于物镜的数值孔径（numerialaperture，N.A.），N.A.又称为镜口率，其数值越大，则表示分辨率越高。
　　图1-2物镜的性能参数及工作距离
　　油镜在使用时需要用香柏油或液状石蜡作为介质，这是因为油镜的透镜和镜孔较小，而光线要通过载玻片和空气才能进入物镜中，玻璃与空气的折光率不同，使部分光线产生折射而损失掉，导致进入物镜的光线减少，而使视野暗淡，物像不清。在玻片标本和油镜之间填充折射率与玻璃近似的香柏油或液状石蜡时（玻璃、香柏油和液状石蜡的折射率分别为1.52、1.51、1.46，空气为1），可减少光线的折射，增加视野亮度，提高分辨率。
　　C线为盖玻片的上表面，（10×）物镜的工作距离为7.63mm；（40×）物镜的工作距离为0.53mm；（100×）物镜的工作距离为0.198mm；10/0.25、40/0.65、100/1.25表示镜头的放大倍数和数值孔径。160/0.17表示显微镜的机械镜筒长度（标本至目镜的距离）和盖玻片的厚度，即镜筒长度为160mm，盖玻片厚度为0.17mm。
　　不同的物镜有不同的工作距离。所谓工作距离是指显微镜处于工作状态（焦距调好、物像清晰）时，物镜最下端与盖玻片上表面之间的距离。物镜的放大倍数与其工作距离成反比。当低倍镜被调节到工作距离后，可直接转换高倍镜或油镜，只需要用细调螺旋稍加调节焦距便可见到清晰的物像，这种情况称为同高调焦。
　　不同放大倍数的物镜也可从外形上加以区别，一般来说，物镜的长度与放大倍数成正比（表1-1）。表1-1标准物镜的性质
　　放大倍数数值孔径工作距离/mm100.206.5200.502.0400.650.61001.250.2
　　3）照明装置
　　光源：反光镜，位于聚光镜的下方，可向各方向转动，能将来自不同方向的光线反射到聚光器中。反光镜有两个面，一面为平面镜，另一面为凹面镜，凹面镜有聚光作用，适于较弱光和散射光下使用，光线较强时则选用平面镜（现在有些新型的光学显微镜都有自带光源，而没有反光镜；有的二者都配置）。
　　聚光器：位于载物台的通光孔的下方，由聚光镜和光圈构成，其主要功能是光线集中到所要观察的标本上。聚光镜由2~3个透镜组合而成，其作用相当于一个凸透镜，可将光线汇集成束。在聚光器的左下方有一调节螺旋可使其上升或下降，从而调节光线的强弱，升高聚光器可使光线增强，反之则光线变弱。
　　光圈也称为彩虹阑或孔径光阑，位于聚光器的下端，是一种能控制进入聚光器的光束大小的可变光阑。它由十几张金属薄片组合排列而成，其外侧有一小柄，可使光圈的孔径开大或缩小，以调节光线的强弱。在光圈的下方常装有滤光片框，可放置不同颜色的滤光片。
　　3.普通光学显微镜的使用方法
　　（1）准备：将显微镜小心地从镜箱中取出（移动显微镜时应以右手握住镜臂，左手托住镜座），放置在实验台的偏左侧，以镜座的后端离实验台边缘6~10cm为宜。首先检查显微镜的各个部件是否完整和正常，如果是镜筒直立式光镜，可使镜筒倾斜一定角度（一般不应超过45°角）以方便观察（观察临时装片时禁止倾斜镜臂）。
　　（2）低倍镜的使用方法
　　1）对光：打开实验台上的工作灯（如果是自带光源显微镜，这时应该打开显微镜上的电源开关），转动粗调螺旋，使镜筒略升高（或使载物台下降），调节物镜转换器，使低倍镜转到工作状态（即对准通光孔），当镜头完全到位时，可听到轻微的扣碰声。
　　打开光圈并使聚光器上升到适当位置（以聚光镜上端透镜平面稍低于载物台平面的高度为宜）。然后向着目镜内观察，同时调节反光镜的方向（自带光源显微镜，调节亮度旋钮），使视野内的光线均匀、亮度适中。
　　2）放置玻片标本：将玻片标本放置到载物台上，用标本移动器上的弹簧夹固定好（注意：使有盖玻片或有标本的一面朝上），然后转动标本移动器的螺旋，使需要观察的标本部位对准通光孔的中央。
　　3）调节焦距：用眼睛从侧面注视低倍镜，同时用粗调螺旋使镜头下降（或载物台上升），直至低倍镜头距玻片标本的距离小于0.6cm（注意：操作时必须从侧面注视镜头与玻片的距离，以避免镜头碰破玻片）。然后在目镜上观察，同时用左手慢慢转动粗调螺旋使镜筒上升（或使载物台下降）直至视野中出现物像为止，再转动细调螺旋，使视野中的物像最清晰。
　　如果需要观察的物像不在视野中央，甚至不在视野内，可用标本移动器前后、左右移动标本的位置，使物像进入视野并移至中央。在调焦时如果镜头与玻片标本的距离已超过了1cm还未见到物像时，应严格按上述步骤重新操作。
　　（3）高倍镜的使用方法
　　1）在使用高倍镜观察标本前，应先用低倍镜寻找到需观察的物像，并将其移至视野中央，同时调准焦距，使被观察的物像最清晰。
　　2）转动物镜转换器，直接使高倍镜转到工作状态（对准通光孔），此时，视野中一般可见到不太清晰的物像，只需调节细调焦螺旋，一般都可使物像清晰。
　　（4）油镜的使用方法
　　1）用高倍镜找到所需观察的标本物像，并将需要进一步放大的部分移至视野中央。
　　2）将聚光器升至最高位置并将光圈开至最大（因油镜所需光线较强）。
　　3）转动物镜转换盘，移开高倍镜，在玻片标本上需观察的部位（载玻片的正面，相当于通光孔的位置）滴一滴香柏油（折光率1.51）或液状石蜡（折光率1.47）作为介质，然后在眼睛的注视下，使油镜转至工作状态。此时油镜的下端镜面一般应正好浸在油滴中。
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