本书分为基础性实验和综合性实验两部分，其中基础性实验分为9章36个实验，是细胞生物学中最基本的实验技术。综合性实验6个，实验中需要综合应用多种研究技术，对培养学生的综合能力、动手能力、分析和解决问题的能力很有帮助。 《细胞生物学实验》可作为高等院校生命科学类专业本科细胞生物学基础实验课程的教材，特别适台师范院校生命科学专业的学生使用，也可供相关科研及实验技术人员参考。
本书内容主要包括基础性实验和综合性实验 两部分。基础性实验包括各种显微镜的使用、细胞形态和结构的观察、细胞化学、细胞膜生理、细胞分裂、细胞培养、生物大分子的原位检测、细胞的分选和分析及 细胞凋亡的检测共9章36个实验，这里面既有传统的细胞生物学经典实验，也有现代细胞生物学研究的新技术、新方法，是最能代表本学科特点的实验方法和技 术。
前言
第1部分基础性实验
第一章显微镜技术
实验1普通光学显微镜及其使用
实验2光学显微镜标本的制作技术及HE染色
实验3特殊显微镜的原理和使用
实验4激光扫描共焦显微镜的原理与使用
实验5透射电镜的原理与使用
实验6扫描电镜的原理与使用
第二章细胞形态与结构的观察
实验7不同细胞形态的观测及大小的测量
实验8线粒体和液泡系的活体染色与观察
实验9叶绿体的分离纯化与荧光观察
实验10考马斯亮蓝染色显示植物细胞骨架及其光镜观察
实验11间接免疫荧光标记法显示动物细胞中的微管
第三章细胞化学
实验12甲基绿派洛宁染色显示DNA和RNA在细胞中的分布
实验13Feu1gen反应显示细胞中DNA的分布
实验14PAS反应显示细胞中糖原的分布
实验15脂类的细胞化学
实验16酶的细胞化学——酸性磷酸酶的显示
第四章细胞膜生理
实验17活细胞与死细胞的鉴定
实验18细胞膜的通透性
实验19小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的观察
实验20植物凝集素对红细胞的凝集作用
第五章细胞分裂及染色体标本的制备
实验21有丝分裂
实验22减数分裂
实验23植物根尖染色体标本制备
第六章细胞培养
实验24动物细胞原代培养
实验25动物细胞传代培养
实验26动物细胞冻存与复苏
实验27植物细胞悬浮培养“
第七章核酸、蛋白质的原位检测
实验28原位杂交
实验29免疫组织与细胞化学技术
第八章细胞的分选与分析——流式细胞技术
实验30流式细胞仪测定细胞周期
第九章细胞凋亡的检测
实验31细胞凋亡的形态学观察
实验32凋亡细胞的琼脂糖凝胶电泳检测——DNA 1adder
实验33凋亡细胞原位末端标记法检测——TUNEL
实验34流式细胞仪检测细胞凋亡
实验35线粒体膜电位检测细胞凋亡
实验36caspase3活性测定检测细胞凋亡
第2部分综合性实验
实验37低温诱导植物根尖细胞染色体数目加倍
实验38动物细胞融合(PEG介导的鸡血细胞融合)
实验39动物骨髓细胞染色体标本制作
实验40抑制肿瘤细胞增殖有效成分的筛选
实验41植物原生质体分离、融合与培养
实验42增殖细胞核抗原(PcNA)与海洋浮游植物生长之间的关系
主要参考文献
第1 部分 基础性实验
第一章 显微镜技术
显微镜是观察细胞形态结构的基本工具，有了光学显微镜的发明才有细胞的发现，有了石蜡切片技术和各种染色技术的发明才使得对细胞的内部结构有了一定的认识，电子显微镜的发明和超薄切片技术的出现则加深了人们对细胞细微结构的了解。相差显微镜、微分干涉显微镜和显微操作仪的发明使得对活细胞的观察及外科手术操作变为可能。荧光显微镜在核酸和蛋白质等生物大分子的定位与定性研究方面发挥了重大作用。激光扫描共焦显微镜使得观察活细胞内各种细胞器和生物大分子的动态结构及活动成为可能。
显微镜是细胞生物学研究中最基本的实验工具。掌握显微镜的调试和使用的基本技能，了解各种不同的光学显微镜及电子显微镜的基本原理、特点和应用范围，对于细胞生物学的学习和研究是十分必要的。
实验1 普通光学显微镜及其使用
【实验目的】
1. 了解普通光学显微镜的构造、基本原理、保养方法，掌握光学显微镜的使用方法。
2. 熟悉光镜下细胞的基本形态和结构。
【实验原理】光学显微镜由光学放大系统和机械装置两部分组成。光学系统一般包括目镜、物镜、聚光镜、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等。标本的放大主要由物镜完成，聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱。物镜上方形成一个倒立的放大实像，目镜将此倒像进一步放大成像于人的视网膜上，形成一个正立的实像。判断显微镜性能最重要的指标是分辨率，它主要由物镜决定，实际使用中也与聚光镜相关。
分辨率可用下式表示：R=0.61λ/NA，R值越小，分辨率越大。λ为入射光的波长，NA为物镜的数值孔径。NA=n•sin（α/2），n为介质的折射率，α为镜口角的大小。
【实验用品】
1. 实验器具普通光学显微镜。
2. 实验试剂香柏油、镜头清洗液（乙醚∶无水乙醇=7∶3，或二甲苯）。
3. 实验材料各种动植物组织细胞或微生物永久装片或临时装片。
【方法与步骤】
1. 普通光学显微镜的基本构造
普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分，详见图1-1。
2. 显微镜的使用方法
（1）聚光镜的使用方法聚光镜是光学显微镜照明光路中的重要部件，聚光镜没有调整好会影响显微镜的实际分辨率，也使视野中因杂散光的存在而产生晕光。
1）聚光镜的对中①调出清晰的多边形：将视场光圈和孔径光圈调到最小的状态，若显微镜的状态正确，此时在视野中可以看到一个边缘清楚的多边形。否则，应转动聚光镜的上下调节旋钮，使聚光镜缓慢上升或下降，使得视场中形成一个边缘清晰的多边形。
注意：不要经常调节聚光镜高度。调节好高度后，以后都不要再移动其高低位置。显微镜安装好后，一般都已经调节好高度，所以可以直接进行下一步调节（如果找不到多边形，可将视场光圈稍微放大，视野稍亮就可以找到）。
②多边形调到正中心：视野中多边形的正确位置应该是在视野的正中心，如果不在说明光路有偏移，需要调节聚光镜对中螺钉，使多边形位于视野的中心。
③多边形调成外切：将视场光圈慢慢放大，当多边形正好外切于视场时就是视场光圈的最佳工作位置。此时，聚光镜的光轴与照明光路及成像光路的光轴合轴。调节好后，日常使用中不要随意调整对中螺丝杆。
2）孔径光圈的调节：一般显微镜的聚光镜外侧边缘上均具有刻数及定位记号，便于调节聚光镜与物镜的数值孔径使其相匹配，以取得最佳的分辨率。低数值孔径的物镜要配合低数值孔径的聚光镜；反之，高数值孔径的油镜要配合高数值孔径的聚光镜。若聚光镜外侧没有标刻数字，则先将物镜聚焦，再取出一个目镜，眼睛往镜筒内看，可见物镜后透镜呈一明亮的圆，若看不见孔径光圈的轮廓像，说明孔径过大；若仅是一个很小的明亮轮廓像，则说明孔径过小。
当缓慢增大孔径刚好使物镜后透镜呈一明亮圆时，则聚光镜与该物镜的数值孔径已相互匹配。
（2）低倍镜的使用方法
1）取镜和放置：显微镜平时存放在柜或箱中，用时从柜中取出，右手紧握镜臂，左手托住镜座，将显微镜放在自己左肩前方的实验台上，镜座后端距桌边3.3～6.6cm为宜，便于坐着操作。
2）对光：用拇指和中指移动旋转器（切忌手持物镜移动），使低倍镜对准镜台的通光孔（当转动至听到碰叩声时，说明物镜光轴已对准镜筒中心）。打开光圈，上升聚光镜，调节光圈大小，调节自带光源的亮度旋钮以改变亮度，直到视野内的光线均匀明亮为止。
3）放置玻片标本：取一玻片标本放在镜台上，一定使有盖玻片的一面朝上，切不可放反，用推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，将所要观察的部位调到通光孔的正中。
4）调节焦距：以左手按逆时针方向转动粗调节器，使镜台缓慢地上升至物镜距标本片约5mm处。应注意在上升镜台时，切勿在目镜上观察，一定要从右侧看着镜台上升，以免上升过多，造成镜头或标本片的损坏。然后，两眼同时睁开，在目镜上观察，左手顺时针方向缓慢转动粗调节器，使镜台缓慢下降，直到视野中出现清晰的物像为止。
如果物像不在视野中心，可调节推片器将其调到中心（注意玻片移动的方向与视野物像移动的方向是相反的）。如果视野内的亮度不合适，可通过升降聚光镜的位置或调整光圈的大小来调节。如果在调节焦距时，镜台下降已超过工作距离（>5.40mm）而未见到物像，说明此次操作失败，则应重新操作，切不可盲目地上升镜台。
（3）高倍镜的使用方法
1）选好目标：一定要先在低倍镜下把需进一步观察的部位调到中心，同时把物像调节到最清晰的程度，再进行高倍镜的观察。
2）转动转换器，调换高倍镜头：转换高倍镜时转动速度要慢，并从侧面进行观察（防止高倍镜头碰撞玻片），如高倍镜头碰到玻片，说明低倍镜的焦距没有调好，应重新操作。
3）调节焦距：转换好高倍镜后，用双眼在目镜上观察，此时一般能见到一个不太清楚的物像，可将细调节器的螺旋逆时针转动0.5～1 圈，即可获得清晰的物像（此时切勿再用粗调节器!）。如果视野的亮度不合适，可用聚光镜和光圈加以调节。当需要更换玻片标本时，必须顺时针（切勿转错方向）转动粗调节器使镜台下降，方可取下玻片标本。
（4）油镜的使用方法
1）在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。
2）将聚光镜上升到最高位置，光圈开到最大。
3）转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜。在转换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破玻片为宜。
4）微调焦：一般情况下，从高倍镜转到油镜即可观察到物像，用双眼于目镜观察，并慢慢转动细调节器至物像清晰为止。转动过程中，油镜可能会离开油滴，此时，需要再小心地将镜头浸入油滴中，最好使镜头尽量贴近玻片，然后再微调使之逐渐远离玻片，防止玻片与镜头的碰撞。
如果不出现物像或者目标不理想要重找，在油区之外重找时的程序为：低倍→高倍→油镜；在油区内重找的程序为：低倍→油镜，此时不可使用高倍镜，以免油沾污镜头。
5）调节孔径光圈和视场光圈，将孔径光圈调到最大，与油镜的数值孔径相匹配，再调节视场光圈和自带光源的旋钮以达到最佳亮度。
6）油镜使用完毕，将载物台远离镜筒，先用擦镜纸蘸少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。
【注意事项】
1. 持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零件脱落或碰撞到其他地方。
2. 轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。
3. 保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，机械部分用布擦拭。
4. 水滴、乙醇或其他药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。
5. 放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。
6. 不要随意取下目镜，以防尘土落入物镜；也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。
7. 使用完毕后，取下标本片，转动转换器使镜头离开通光孔，下降镜台，下降聚光镜，关闭光圈，推片器回位，盖上外罩，放回镜箱内。最后填写使用登记表。
【思考题】
1. 调节聚光镜及使用油镜时应注意哪些事项？
2. 为什么使用高倍镜和油镜时，必须从低倍镜开始？
实验2 光学显微镜标本的制作技术及HE染色
【实验目的】
1. 掌握光学显微镜标本的制作方法。
2. 掌握HE 染色标本的染色特点，了解HE 染色的过程。
【实验原理】光学显微镜的标本制作方法很多，常用的有：分离法、涂片法（血细胞、分离细胞或脱落细胞）、压片法、铺片法（疏松结缔组织可撕成薄片）、磨片法（牙和骨等坚硬组织可磨成薄片）、血管注射法、切片法，多数都需经过染色后才能在镜下观察。
石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片的基础上发展起来的。苏木精（hematoxylin）与伊红（eosin）对比染色法（HE 染色）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色，可长期保存。经过HE 染色，细胞核被苏木精染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈红色。
【实验用品】
1. 实验器具切片刀、切片机、恒温箱、显微镜、温度计、水浴锅、温台、熔蜡炉、蜡杯、酒精灯、蜡铲、展片台、解剖刀、解剖针、解剖剪、解剖盘、培养皿、吸管、镊子、单面刀片、台木、毛笔、包埋纸盒、染色缸、盖玻片、载玻片、玻片盘、树胶、树胶瓶。
2. 实验试剂
（1）Carnoy 固定液：甲醇∶冰醋酸=3∶1。
（2）Ehrich 苏木精染液：取苏木精1.0g，冰醋酸5ml，乙醇50ml，甘油50ml，硫酸铝钾5g，蒸馏水50ml。将苏木精溶于少量的乙醇中，再加冰醋酸并搅拌，以加速其溶解。当苏木精溶解后将甘油加入并摇动容器，同时加入剩余的乙醇。硫酸铝钾需研磨并加热，然后溶解于蒸馏水中，将其逐滴加入染色剂中，并不断摇动，瓶口用纱布盖好，置于通风处，经常摇动以促其成熟，待颜色变为紫红色时即可使用，成熟时间需2～4 周或数月之久。
（3）伊红Y 染液：伊红Y 1.0g，蒸馏水75ml，95%乙醇25ml，冰醋酸1 滴或2 滴。先将少量蒸馏水加入伊红Y 中，用研钵将伊红Y 研碎溶解，再加入全部的蒸馏水，混匀溶解后，加入乙醇、冰醋酸。
（4）甘油蛋白贴片剂：将1个鸡蛋打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。然后加入等量甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入水杨酸钠1g 作防腐用。可保存几个月。
（5）1%盐酸乙醇液：浓盐酸1 份，70%乙醇99 份。
（6）其他：各级乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，中性树胶。
3. 实验材料鼠肝、肾等动物组织。
【方法与步骤】
1. 石蜡标本的制作
（1）取材：断颈处死小鼠，迅速取材，组织块厚度不超过0.5cm。
（2）固定：将组织块浸入Carnoy固定液中进行固定，以保持其本来的结构。
（3）制成蜡块。
1）脱水：为了避免组织过度收缩，脱水过程应从低浓度乙醇开始，在70%、80%、90%、95%的乙醇中各浸6～12h，100%乙醇中3～4h。
2）透明：在二甲苯内至组织块透明为止。
3）浸蜡：透明后的组织块放入熔化的石蜡中（56～60℃），浸2～3h，使石蜡充分浸入组织内部。
4）包埋：先在模具中加入一些液态石蜡，待稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，使石蜡变成固态。
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